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用流式细胞仪检测细胞周期分布的步骤是什么?
解决时间:2009-12-09 23:24 [本文链接:http://ask.bbioo.com/ask/show-3820.html]

用流式细胞仪检测细胞周期分布的步骤是什么?

  • 匿名提问 2009-12-09
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最佳答案 

回答者:匿名用户 时间:2009-12-09
流式检测细胞周期
要点: 最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备!
1、细胞消化要理想,资料显示最好消化时加EDTA,可使流式做的很漂亮;
2、细胞消化后不可吹打过度,减少细胞破碎;以后的吹打也要注意,尤其是固定后的细胞容易破碎;
3、 细胞用PBS洗涤离心,转速不超过1000r/min,有文献用800r/min;可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞(有人主张用钢网,以 减少细胞与尼龙网粘连的损失,本人认为钢网易损伤细胞,DNA外溢也会造成细胞粘连,所以在细胞数足够的情况下,首选尼龙网);
4、离心后的固定,标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精,而不是向细胞中加酒精,这样是为了减少细胞聚集,这一点很重要,很多人都忽视了!
5、一般选择4℃固定过夜;
6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题;
7、 关于PI染液的组成及配方,应主要以文献为主,PI(作用为DNA染色剂)的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml,到50μg/ml都见报道,响应的 求助显示都可出良好结果,RNAs酶(由于PI也可染RNA,故要去除RNA)一般浓度为50μg/ml,配方中的Triton-X-100(曲拉通)主 要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。
8、检测时细胞要达到1~2×106个细胞(实际检测是1万到2万个细胞),为了既保持初始条件相同,又可搜 集到足够的细胞,应选用多孔培养板,在搜集细胞时,浓度大、抑制强的组可多搜集些孔,以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低,技师为了减少对流式细胞仪 的损伤,就会选择高速流(一般的检测用低速流,误差小),检测的质量就会大大下降,数据的说服力就下降了!
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 流式细胞仪分析(组织)步骤
取 新鲜瘤组织0.5cm3。加入PBS液适量,常温下剪碎至肉泥样,用300目尼龙网过滤,1200r/min离心5min,去上清,反复3次,留 0.5ml。在单细胞悬液中加入95%的冷乙醇.于4℃ 固定12小时以上。然后加PBS液在室温下离心,1200r/min,反复2~3次,洗去固定液,细胞计数在1×106 个/ml。取悬液50ul,加入PI100u1,染色20min以上。上机测定5×103 个细胞,并用Muticycle软件分析细胞周期。 

作者:yixiu 时间:2009-12-09 23:57  共0人支持此评论
流式步骤:
取对数生长期细胞,常规消化制成单细胞悬液,以1.25 ×105/ml密度接种于T-25培养瓶中,24h后加入各浓度消癌平注射液(10, 20, 40mg/ml)培养24h,收集所有细胞,将约1×106个细胞移入离心管中,1000rpm离心5分钟,弃去上清后,用PBS溶液清洗一次,在离心管中留约0.5mlPBS,加入70%冰乙醇5ml混匀固定,4℃放置48h以上。检测时,离心离去乙醇,PBS清洗一次,在离心管中留1mlPBS,打散细胞团,加入Rnase5ul(10mg/ml),37℃放置1h,加入PI(100ug/ml)染液,室温避光染色30分钟,计数10000个细胞,流式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡情况,进行细胞凋亡的分析,亚Go/G,峰为凋亡细胞峰。
作者:yixiu 时间:2009-12-09 23:59  共0人支持此评论
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