用流式细胞仪检测细胞周期分布的步骤是什么？-细胞实验问题-生物秀知道

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用流式细胞仪检测细胞周期分布的步骤是什么？

解决时间：2009-12-09 23:24 [本文链接：http://ask.bbioo.com/ask/show-3820.html]

用流式细胞仪检测细胞周期分布的步骤是什么？

匿名提问 2009-12-09

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回答者：匿名用户时间:2009-12-09

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流式检测细胞周期
要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！
1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；
2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；
3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；
4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！
5、一般选择4℃固定过夜；
6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；
7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。
8、检测时细胞要达到1～2×106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！

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流式细胞仪分析（组织）步骤
取新鲜瘤组织0.5cm³。加入PBS液适量，常温下剪碎至肉泥样，用300目尼龙网过滤，1200r／min离心5min，去上清，反复3次，留 0.5ml。在单细胞悬液中加入95％的冷乙醇．于4℃ 固定12小时以上。然后加PBS液在室温下离心，1200r／min，反复2～3次，洗去固定液，细胞计数在1×10⁶ 个／ml。取悬液50ul，加入PI100u1，染色20min以上。上机测定5×10³个细胞，并用Muticycle软件分析细胞周期。
作者：yixiu 时间：2009-12-09 23:57 共0人支持此评论

流式步骤：
取对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，以1.25 ×10⁵/ml密度接种于T-25培养瓶中，24h后加入各浓度消癌平注射液(10, 20, 40mg/ml)培养24h，收集所有细胞，将约1×10⁶个细胞移入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清后，用PBS溶液清洗一次，在离心管中留约0.5mlPBS，加入70％冰乙醇5ml混匀固定，4℃放置48h以上。检测时，离心离去乙醇，PBS清洗一次，在离心管中留1mlPBS，打散细胞团，加入Rnase5ul(10mg/ml)，37℃放置1h，加入PI（100ug/ml）染液，室温避光染色30分钟，计数10000个细胞，流式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡情况，进行细胞凋亡的分析，亚Go/G,峰为凋亡细胞峰。
作者：yixiu 时间：2009-12-09 23:59 共0人支持此评论

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