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做流式细胞仪之前,如何固定细胞?
离问题结束还有 -1571天-11小时-4分 [本文链接:http://ask.bbioo.com/ask/show-3840.html]

最近准备作流式细胞 仪,准备测定a-SMA(+)细胞百分数,因为a-SMA是胞浆内蛋白,还需要固定、打孔,文献多报道用1%多聚甲醛固定,不清楚的是:固定前是将细胞悬 液离心弃上清后再加固定液,还是直接向细胞悬液中加固定液?固定时加多少多聚甲醛?还请大家指教,谢谢!

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  • 匿名提问 2009-12-11
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秀友回答 (1)

  • 一 般来说都是将细胞悬液离心并弃上清后加入固定液,我们加的是70%的冰乙醇,加的量根据你细胞的多少。你这个涉及的测蛋白,那么加多聚甲醛的量和时间可能 要控制得严一些才能保证最低限度不破坏a-SMA的结构。如果单测细胞凋亡和周期的话固定液多一点和固定时间长一点都影响不是太大。

    其实无论是做细胞周期 的乙醇固定,还是做蛋白染色的多聚甲醛固定,固定液加1mL就可以了,一般每个样品的细胞数都在106左右。固定液太少了不好,因为固定液的实际作用浓 度一定程度上受弃上清后管内残留液体量的影响,但太多了也没有意义。也正是这个原因,实际上多聚甲醛的浓度用4%的多一些,而且因其有挥发性,时间长浓度 会有所降低。至于固定时间,一般4度30min固定作用就已经比较完全了,但是也可以放置过夜,这样有时有利于时间安排。
  • 匿名回复 时间:2009-12-11

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